完整酶結(jié)構(gòu)      郭瑞庭供圖

電子傳遞機(jī)制      郭瑞庭供圖

5月29日，《自然—通訊》在線發(fā)表了首個細(xì)胞色素P450酶的全長精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，解答了這一數(shù)十年未解的科學(xué)難題。

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授陳純琪、馬立新和郭瑞庭合作完成了這項(xiàng)工作。他們解析了一種P450酶CYP116B46的晶體結(jié)構(gòu)，并闡明電子在分子內(nèi)傳遞的方式。這對了解P450的結(jié)構(gòu)及完整機(jī)理提供了重要指導(dǎo)，且對P450酶在醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要價值。

萬能生物催化劑

細(xì)胞色素P450是一種酶蛋白，最早于1955年在老鼠的肝臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠渑c一氧化碳結(jié)合的還原態(tài)吸收光譜波長約在450 nm而得名。

該蛋白由血紅素（heme）結(jié)構(gòu)域和含有黃素單核苷酸（FMN）的還原酶結(jié)構(gòu)域組成；這兩個部分通過包含鐵硫簇的鐵氧還蛋白域相連。“細(xì)胞色素P450是一個龐大的酶家族，簡稱為CYP，參與許多天然產(chǎn)物的合成途徑與毒物、藥物代謝反應(yīng)。”論文通訊作者陳純琪告訴《中國科學(xué)報》，在植物中，P450家族參與一些特殊化合物的合成，如青蒿素和紫杉醇；在人體中，P450家族主要參與解毒過程，如化解可以導(dǎo)致癌癥的黃曲霉毒素等。

這是因?yàn)镻450的催化多能性很高，涉及20余類反應(yīng)，包括羥化反應(yīng)、環(huán)氧化反應(yīng)和成環(huán)反應(yīng)等。其底物譜極廣，可以識別芳香族、聚酮類、萜類、肽類、糖類等類型的底物，擁有“萬能生物催化劑”之稱。

它還具有高度區(qū)域選擇性和立體選擇性，能特異性的識別結(jié)構(gòu)位點(diǎn)和方向。此外，P450酶的底物結(jié)合區(qū)具有高度可塑性，透過酶工程改造可以改變底物譜，在重要化學(xué)品和藥物制造方面的應(yīng)用深具潛力。

因此，藥物活性化與代謝主要都是由CYP這個酶家族所負(fù)責(zé)的，大約囊括了生物體中此類代謝的75%。

P450系統(tǒng)廣泛存在于所有生物甚至病毒中，已發(fā)現(xiàn)超過18000種P450系統(tǒng)。人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過57種P450系統(tǒng)，大部分是膜蛋白，主要分布在粒線體內(nèi)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。不過，在大腸桿菌中未發(fā)現(xiàn)此類酶蛋白的蹤影。

“絕大多數(shù)P450酶需要氧化還原酶來提供電子，以活化底物結(jié)合區(qū)的血紅素，進(jìn)而轉(zhuǎn)化底物。”陳純琪說，建立一個P450系統(tǒng)必須尋找同源或者相匹配的氧化還原酶。

在P450系統(tǒng)的9個家族中，只有2個家族在同一條多肽鏈上自帶氧化還原酶，被稱為自給自足的P450酶，這類酶主要來自細(xì)菌。另外一些P450系統(tǒng)則需要從外界獲得匹配的氧化還原酶，這種情況主要發(fā)生在動物體內(nèi)。

“自給自足的P450酶在生物技術(shù)應(yīng)用方面是極具吸引力的生物催化劑。因此，自給自足P450酶內(nèi)部電子如何傳遞是一個非常有趣且重要的課題。”論文通訊作者郭瑞庭告訴《中國科學(xué)報》，此前，科學(xué)家已經(jīng)對P450系統(tǒng)中的血紅素和FMN等結(jié)構(gòu)域研究比較清楚，但對中間連接部分始終不了解，缺乏全長精細(xì)結(jié)構(gòu)。

“在蛋白純化及培養(yǎng)晶體的過程中，P450酶極易從中間斷裂或降解，因而很難獲得完整的全長三維立體結(jié)構(gòu)。”陳純琪說。

獲得全長P450精細(xì)三維結(jié)構(gòu)

目前已知的自給自足P450酶有兩類。第一類以來源于巨大芽孢桿菌的CYP102A1為代表，由氮端的血紅素結(jié)構(gòu)域和碳端的P450還原酶 （CPR）組成，電子傳遞的方向是從碳端向氮端傳遞。雖然這類P450酶的全長精細(xì)結(jié)構(gòu)仍然缺失，但對于這類P450酶的電子傳遞機(jī)理也有了一些粗略的理論。

第一類自給自足P450酶結(jié)構(gòu)域排列      郭瑞庭供圖

第二類是CYP116，該研究所涉及的CYP116B46就屬于這一類。這類P450由氮端的 heme結(jié)構(gòu)域和碳端的鄰苯二甲酸二加氧酶還原酶類結(jié)構(gòu)域（PDR）組成，PDR包含了FMN-依賴的還原酶結(jié)構(gòu)域與鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域。

第二類自給自足P450酶結(jié)構(gòu)域排列      郭瑞庭供圖

自給自足P450酶的一條多肽鏈內(nèi)是如何將電子從碳端傳遞到氮端的血紅素的？由于30多年來長期缺乏全長的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，在該項(xiàng)研究之前尚不清楚。

英國曼徹斯特大學(xué)化學(xué)生物學(xué)教授薩賓·L·弗利奇（Sabine L. Flitsch）說：“獲得全長酶是一項(xiàng)了不起的成就。”許多小組，包括她自己的小組，都試圖解析這些結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈冏鳛樯锎呋瘎┚哂兄卮蟮膽?yīng)用潛力。

“可以說晶體制備已經(jīng)超越科學(xué)，幾乎成為一門藝術(shù)。”陳純琪說，要想獲得一個完整的大蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其難度可想而知。

該研究所用的CYP116B46相對穩(wěn)定，加上郭瑞庭長年從事晶體制備和結(jié)構(gòu)解析工作積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，他們得以利用X射線晶體學(xué)對其完整的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

結(jié)構(gòu)分析表明，在這種酶中，F(xiàn)MN足夠接近鐵硫簇以實(shí)現(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移；但血紅素離鐵硫簇太遠(yuǎn)，不允許電子直接轉(zhuǎn)移，而是依靠5個“二傳手”氨基酸實(shí)現(xiàn)傳遞。

“我們解析了來源于CYP116B46全長的晶體結(jié)構(gòu)，且建立了清晰的酶結(jié)構(gòu)模型。”郭瑞庭說，這條連續(xù)性的多肽折疊成三個結(jié)構(gòu)域，由兩段連接肽相連，從氮端到碳端依序?yàn)椋貉t素結(jié)合域、還原酶結(jié)構(gòu)域和鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域。

郭瑞庭介紹，結(jié)構(gòu)解析后發(fā)現(xiàn)，CYP116B46三個結(jié)構(gòu)域的排列與電子傳遞的方向竟然非常一致。血紅素結(jié)合域的底物結(jié)合區(qū)朝向外，有利于底物進(jìn)入結(jié)合，這顯示結(jié)構(gòu)的排列相當(dāng)合理。其中，還原酶結(jié)構(gòu)域和鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的直線距離為7.9Å，有利于電子的直接傳遞。

“科學(xué)家普遍認(rèn)為，小于8 Å的距離是電子可以直接傳遞過去的。”郭瑞庭說。

另一方面，鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和血紅素的直線距離達(dá)25.3 Å，超過目前認(rèn)定的有效直接電子傳遞距離。

5個“二傳手”傳遞電子

“在這兩個氧化還原中心之間，由其他輔助因子來幫助電子傳送的可能性較低。”郭瑞庭解釋說，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)顯示二者之間的通道狹窄，缺乏其他輔助因子結(jié)合的特征。另一方面，考慮到氨基酸也是一種電子載體，所以二者之間的氨基酸也有可能在電子傳送的過程中扮演重要角色。

“現(xiàn)在我們有機(jī)會設(shè)計還原酶結(jié)構(gòu)域和電子轉(zhuǎn)移途徑。”陳純琪說。

為了分析這些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)對于CYP116B46酶活性的影響，他們將這些位點(diǎn)分別突變成丙氨酸，并進(jìn)行產(chǎn)物生成量的測定來評估每個氨基酸扮演的角色。

郭瑞庭介紹，酶活測試結(jié)果顯示，R388、R718、E723、S726和E729的丙氨酸突變體活性明顯下降。將這些位點(diǎn)再次標(biāo)定在結(jié)構(gòu)上，可以看出大致的電子傳遞方向。

R378A突變體蛋白質(zhì)缺乏血紅素造成的紅色，一氧化碳處理后也沒有出現(xiàn)吸收峰帶移的現(xiàn)象。加上R378的所在位置鄰近血紅素，推測R378可能與結(jié)合血紅素相關(guān)。因此，R378A的突變造成的效應(yīng)更加復(fù)雜，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)才能判斷此一位點(diǎn)對于CYP116B46電子傳遞的影響。

[2Fe-2S] 與heme通道的氨基酸突變驗(yàn)證         郭瑞庭供圖

“知道了氨基酸在電子傳遞過程中扮演的角色之后，我們就可以考慮尋找替換別的有效氨基酸，提高電子傳遞效率。”郭瑞庭解釋說，這就好像換上一個手更長的“二傳手”，讓電子能更快的傳遞過去。

這種設(shè)計將提高催化反應(yīng)的效率。P450全長結(jié)構(gòu)的解析，對于了解自給自足P450酶催化機(jī)理是一個非常重要的里程碑，對于P450酶改造與應(yīng)用更具有重要的指導(dǎo)意義。

相關(guān)論文信息：https://doi.otg/10.1038/s41467-020-16500-5