向日葵為什么總是向著太陽？在植物體內(nèi)有一種稱為生長素的物質(zhì)，如同人體內(nèi)生長激素一樣，它負責(zé)給細胞傳達信息，指揮植物的生長發(fā)育。受光照影響，生長素會從向日葵莖端向光側(cè)運輸?shù)奖彻鈧?cè)，產(chǎn)生濃度差異。由此，背光側(cè)生長會更快一些，而向光側(cè)慢一些，向日葵的花盤自然就朝向太陽。

生長素的運輸需要細胞膜上的“搬運工”——轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助，其中非常重要的一員是負責(zé)將生長素從細胞內(nèi)搬運到細胞外的PIN家族蛋白。這些“搬運工”長什么樣？又是如何工作？

8月2日，《自然》雜志上以“快速通道”形式發(fā)表了中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部孫林峰教授團隊在植物生長機理上的重大進展，揭示了生長素“搬運工”成員PIN1蛋白，以及它分別與抑制劑NPA（又名抑草生）、生長素IAA結(jié)合的三個高分辨率結(jié)構(gòu)，并通過功能分析闡釋了PIN1“搬運”生長素的機制，為理解植物生長素運輸調(diào)控以及針對PIN家族蛋白的農(nóng)業(yè)用除草劑和生長調(diào)節(jié)劑的設(shè)計開發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。

擬南芥PIN1蛋白三種狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機制示意圖 課題組供圖

中國科大生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部孫林峰教授團隊部分成員合影 代蕊 攝

亟待解決的科學(xué)問題

作為第一個被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長素幾乎參與了植物生長發(fā)育調(diào)控的每個過程，如胚胎發(fā)育、向光性和向重力性生長等。生長素一個顯著特點是其細胞間傳遞具有方向性，被稱為極性運輸，而PIN家族蛋白在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

特定PIN家族成員在細胞質(zhì)膜上具有不對稱分布的特點，它們的分布位置決定了生長素“搬運”的方向。但是由于缺乏精細的三維結(jié)構(gòu)，PIN家族蛋白特異性識別、轉(zhuǎn)運生長素的機制一直未知。

NPA是之前在實驗室廣泛應(yīng)用的一種生長素極性運輸抑制劑，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最早作為除草劑應(yīng)用的化學(xué)小分子之一。它可以直接靶向PIN家族蛋白，但是如何發(fā)揮作用的機制尚不清楚。

孫林峰教授在實驗室 代蕊 攝

孫林峰表示，解析PIN家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)是生長素研究領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問題。該結(jié)構(gòu)的揭示，不僅有助于理解生長素的“搬運”過程，同時基于這些結(jié)構(gòu)，有利于研究人員針對PIN家族蛋白設(shè)計小分子抑制劑，找到更高效、對環(huán)境更友好、對人類更安全的除草劑和生長調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

此次研究中，孫林峰團隊選擇了PIN家族中經(jīng)典的，也是最早鑒定出的PIN家族成員之一——擬南芥PIN1蛋白作為研究對象。

成功揭示PIN1蛋白結(jié)構(gòu)

“第一步，我們需要證實PIN1蛋白確實可以運輸生長素。”孫林峰說，團隊花了一年多時間，搭建出一套全新的、基于放射性同位素的功能檢測體系，驗證了PIN1蛋白的生長素“搬運”活性，以及受激酶激活、被NPA抑制的過程。

第二步，表達和純化PIN1蛋白。“簡單來說，就是需要獲取足量的適于結(jié)構(gòu)解析的蛋白樣品。”孫林峰說，這是最難的一步，因為PIN1蛋白在植物體內(nèi)含量非常低，不能滿足實驗過程中研究量的需求，因此需要借助于其他細胞表達系統(tǒng)，對蛋白進行富集。

孫林峰教授在指導(dǎo)團隊 代蕊 攝

事實上，從2017年建立起團隊，開始這項課題研究，一直到2021年，前四年的時間里，他們一直在摸索不同表達和純化、冷凍樣品制備等條件。

“當(dāng)時，我們每天很早就到了實驗室，開始一天的工作。我們希望早點優(yōu)化得到性質(zhì)較好的蛋白，加快實驗進度，所以經(jīng)常忙的連水都顧不上喝。”論文第一作者、中國科大生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部博士研究生楊智森說，最終利用哺乳動物表達體系成功獲得了優(yōu)質(zhì)樣品。

第三步，利用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)解析蛋白結(jié)構(gòu)。“冷凍電鏡相當(dāng)于蛋白分子的‘攝影師’，可以從不同角度給蛋白‘拍照’，然后利用這些二維照片重構(gòu)出三維結(jié)構(gòu)”，孫林峰作了一個類比。

“冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集借助了中國科大冷凍電鏡中心和中科院生物物理所生物成像中心提供的優(yōu)秀平臺，其中中國科大冷凍電鏡中心的300kV高端電鏡是2019年開始安裝，2020年正式投入運行，為我們結(jié)構(gòu)研究提供了‘利器’”，孫林峰說道。

但是PIN1蛋白“不穩(wěn)定”，并且分子量較小。如何使它們“變大”并保持一種相對靜止的狀態(tài)？團隊與中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心李典范團隊合作，篩選得到了靶向PIN1蛋白的納米抗體，并首次揭示了經(jīng)典PIN家族蛋白成員的三維結(jié)構(gòu)。

一輪審稿人“恭喜”團隊

在這項研究中，團隊又進一步解析出了PIN1與生長素IAA、抑制劑NPA結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，揭示了PIN1蛋白如何“裝載”生長素，以及NPA“鳩占鵲巢”阻制生長素“搬運”的全貌。

在以上研究的基礎(chǔ)上，團隊利用搭建的功能檢測體系，驗證了結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)的一些重要氨基酸位點發(fā)揮的作用，并提出了PIN家族蛋白運輸生長素的模型。

孫林峰教授和高永翔工程師在300kV電鏡上樣間轉(zhuǎn)移樣品 代蕊 攝

從2017年團隊成立并開始這項課題研究到2022年在《自然》雜志上發(fā)表論文，整五年的時間過去了。“這期間，我們經(jīng)過了無數(shù)次失敗的嘗試，好在學(xué)生和我們都沒有放棄。”孫林峰說。

相比于研究過程，論文投稿還算比較順利。“今年1月份我們向《自然》雜志投稿，2月份就收到第一輪評審意見。”孫林峰說，這個速度在投稿中算比較快，并且評審人都給予了正面的評價。

第一位審稿人評價：“我們應(yīng)該恭喜作者們獲得這一系列PIN1蛋白的重要結(jié)構(gòu)。在植物生理學(xué)領(lǐng)域，生長素運輸?shù)闹匾圆谎远鳎髡邆儷@得的這一系列結(jié)構(gòu)對于我們理解生長素IAA如何被PIN識別和轉(zhuǎn)運做出了重要貢獻”。

第二位審稿人評價：“這一研究是開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，是從事生長素運輸研究的同仁們翹首以盼的成果”。

遵照審稿人意見，6月份團隊又投回了修改版本；再經(jīng)過一輪“精雕細琢”后，7月25日被《自然》正式接收。

孫林峰表示，下一步，團隊將繼續(xù)研究PIN1蛋白的動態(tài)轉(zhuǎn)運過程，捕捉不同狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)，并進一步研究PIN1蛋白受磷酸化激活及調(diào)控的機理，更深入的理解PIN家族蛋白運輸生長素的機制。同時，基于三維結(jié)構(gòu)設(shè)計、篩選化學(xué)小分子，力圖發(fā)現(xiàn)更安全有效的除草劑或植物生長調(diào)節(jié)劑，更好地服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

相關(guān)論文信息： https://www.nature.com/articles/s41586-022-05143-9