9月11日，Science發(fā)表抗癌藥物前體合成最新成果，來(lái)自斯坦福大學(xué)的研究人員鑒定了稀有植物盾葉鬼臼中鬼臼毒素合成途徑中的關(guān)鍵酶，并在煙草中進(jìn)行異源表達(dá)，首次成功合成抗癌藥物依托泊苷的前體物質(zhì)依托泊苷糖苷配基。

     每一次技術(shù)的革新總會(huì)帶來(lái)新的文明，就像蒸汽機(jī)的發(fā)明標(biāo)志著第一次工業(yè)革命的誕生。相信抗瘧疾藥物青蒿酸的異源合成堪稱合成生物學(xué)的重要革新，在一定程度上也象征著天然產(chǎn)物異源合成革命的誕生。臨床所需大量藥物都來(lái)源于植物天然產(chǎn)物，然而它們的生物合成基因卻鮮為人知，嚴(yán)重地阻礙了異源合成輔助藥物生產(chǎn)。雖然在異源宿主中進(jìn)行天然產(chǎn)物的合成需要解決各種難題，然而破譯所需的生物催化劑是首當(dāng)其沖的問(wèn)題。目前已知合成途徑并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)或在未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)在異源宿主中工業(yè)化生產(chǎn)的天然產(chǎn)物屈指可數(shù)，僅有青蒿酸、芐基異喹啉生物堿類以及單萜吲哚生物堿類。然而最新一期的Science再次為合成生物學(xué)帶來(lái)了新的希望，來(lái)自斯坦福大學(xué)的研究人員鑒定了稀有植物盾葉鬼臼中鬼臼毒素合成途徑的關(guān)鍵酶類，并將其在煙草中表達(dá)，最終首次合成了依托泊苷的前體物質(zhì)——依托泊苷糖苷配基，為依托泊苷的獲取提供了一種更安全、有效的方式。作為抗癌藥物的前體物質(zhì)，依托泊苷糖苷培基僅需一步化學(xué)合成便可得到臨床所用的藥物，必然廣受關(guān)注，那么它的異源合成是怎樣實(shí)現(xiàn)的呢？

     1.異源合成植物天然產(chǎn)物的必要性

     目前有效的藥用植物代謝產(chǎn)物都來(lái)源于植物提取，人類從植物中獲取藥品的歷史由來(lái)已久，即使今天依然有大約一半的新藥來(lái)自于植物。但是植物固有生長(zhǎng)緩慢的缺點(diǎn)，有些又屬于處于瀕危狀態(tài)的稀有植物，給植物源藥物的應(yīng)用帶來(lái)困難。喜馬拉雅盾葉鬼臼就是一個(gè)很好的例子，其自身能夠合成抗癌藥物依托泊苷的前體鬼臼毒素，美國(guó)自1983年起，便廣泛將依托泊苷應(yīng)用于肺癌、淋巴癌等癌癥的治療?，F(xiàn)今鬼臼毒素主要是從美國(guó)盾葉鬼臼獲得，但是較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期和較低的產(chǎn)量限制了該藥物的廣泛使用。如果實(shí)現(xiàn)異源合成，規(guī)?；囵B(yǎng)易于操作的宿主，如煙草、酵母以及大腸桿菌等細(xì)胞，相信不只能推動(dòng)合成生物學(xué)的革命浪潮，更將成為造福人類醫(yī)療健康的宏偉工程。

     2.依托泊苷與破譯工作的意義究竟是什么？

     依托泊苷作是由活性天然產(chǎn)物鬼臼毒素經(jīng)半合成得到的衍生物，通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II來(lái)引起DNA雙鏈斷裂，阻止癌細(xì)胞的快速分裂，因此被用于化療多種惡性腫瘤而廣泛應(yīng)用于臨床。雖然依托泊苷被世界衛(wèi)生組織列為必須的關(guān)鍵藥品，但其生產(chǎn)過(guò)程還是依賴于從盾葉鬼臼中提取前體物質(zhì)鬼臼素，再進(jìn)行化學(xué)法半合成。

     因此迫切需要拓寬依托泊苷前體的來(lái)源，首先當(dāng)然需要解決最大的障礙，破譯盾葉鬼臼中的鬼臼素合成基因。相信這是作者的初衷，然而最后的結(jié)果中，得到破譯的途徑終產(chǎn)物并不是鬼臼素，而是鬼臼素途徑中的另一個(gè)物質(zhì)，依托泊苷糖苷配基（4′-desmethylepipodophyllotoxin）。這個(gè)物質(zhì)比鬼臼素更適合進(jìn)行依托泊苷的合成，也就是免去了在化學(xué)合成中對(duì)鬼臼素進(jìn)行異構(gòu)化和去甲基化的步驟，直接合成依托泊苷。

     3.依托泊苷(etoposide)前體物質(zhì)合成途徑的破譯過(guò)程

     在盾葉鬼臼中進(jìn)行基因探礦是非常困難的，因?yàn)檫@種稀有植物生長(zhǎng)緩慢、基因組龐大（約16Gb）,未測(cè)序，而且構(gòu)建突變體的方法十分繁瑣。文章主要采用RNA-seq分析、預(yù)測(cè)蛋白共表達(dá)以及質(zhì)譜分析的方法來(lái)破譯依托泊苷糖苷配基合成的相關(guān)酶。由于煙草能通常能正確表達(dá)不同的蛋白，同時(shí)具有快速生長(zhǎng)、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，被選為備選基因異源表達(dá)的宿主。經(jīng)過(guò)已知蛋白DIR、PLR、SDH與CYP718A23在煙草中共表達(dá)以及質(zhì)譜分析中間產(chǎn)物后，Sattely團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)為煙草細(xì)胞提供底物馬臺(tái)樹(shù)脂醇（matairesinol）后更能有效積累中間產(chǎn)物pluviatolide（圖1），因此以此底物為出發(fā)點(diǎn)，啟動(dòng)了鬼臼素（podophyllotoxin）的破譯旅程。

     盾葉鬼臼合成鬼臼毒素用于保護(hù)自身免受病蟲害侵染，只有當(dāng)葉片受到傷害時(shí)，鬼臼毒素才會(huì)合成。Sattely團(tuán)隊(duì)進(jìn)而推測(cè)與傷害應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白可能參與到鬼臼毒素的合成,通過(guò)比較葉片受傷前后RNA-seq數(shù)據(jù)，檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)需要填補(bǔ)空缺反應(yīng)的酶類:O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMTs）、細(xì)胞色素P450(CYPs)、2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶（2-ODDs）以及多元酚氧化酶（PPOs）(圖2)。那如何尋找到負(fù)責(zé)這六個(gè)酶合成的基因呢？基于表達(dá)譜的計(jì)算分析生成了7個(gè)候選基因。研究者進(jìn)一步通過(guò)酶家族分類篩選盾葉鬼臼中34,384個(gè)基因后，對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了分級(jí)群聚，分析了336個(gè)基因，揭示了一個(gè)進(jìn)化枝上的91個(gè)基因，進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)水平分析將這個(gè)進(jìn)化枝濃縮為22個(gè)基因，其中包含了6個(gè)已經(jīng)推測(cè)的候選基因。因此研究者以馬臺(tái)樹(shù)脂醇為出發(fā)底物逐步在煙草中共表達(dá)6個(gè)候選基因，破譯了依托泊苷前體依托泊苷糖苷（4′-desmethylepipodophyllotoxin）配基的途徑，并在煙草中共表達(dá)整條途徑的10個(gè)基因，獲得了依托泊苷糖苷配基的異源合成,目前產(chǎn)率為10.3ng/mg煙草干重。

     當(dāng)然異源合成最終目的還是要走向酵母宿主的，目前是否已有研究團(tuán)隊(duì)正在努力中呢？我們將持續(xù)關(guān)注。

     摘譯自：http://www.sciencemag.org/content/349/6253/1224?related-urls=yes&legid=sci;349/6253/1224